解析手法入門 第6回 DNAメチル化解析の原理と応用

“第5の塩基”としてのメチル化シトシン

~メチル化DNAをゲノムワイドに検出する~

 

DNAメチル化は発生、ゲノムインプリンティング、転移因子のサイレンシング、および遺伝子転写の調節など、無数の生物学的プロセスに関与しています。

単一塩基分解能で5-メチルシトシンのゲノムワイドな分布を理解することは大きな課題です。

 

DNAメチル化の解析については、様々な報告がなされています。

結合エレメント内でのシトシンDNAメチル化によるSP1転写因子およびインカレータータンパク質CTCFの結合の阻害が実証されています。

さらに、EGR1:神経成長因子誘導性プロテインA [NGFI-A]と転写因子の結合部位内に位置する5 ‘CpGにおけるメチル化の増加は、 EGR1の結合、GRプロモーター活性の阻害、およびGR遺伝子のより低いEGR1誘導性転写を有することが解明されました。

 

一塩基分解能でのメチル化シトシンの同定により、各配列の状況におけるメチル化の量や分布、DNAメチル化に関連する過剰発現および過小発現に関与する配列モチーフを分類することができ、ユークロマチン、ヘテロクロマチン、遺伝子体、テロメア、トランスポゾンを含む多様なゲノム環境におけるメチル化の特徴を検出することが可能となりました。

またDNAメチル化部位の空間的パターニングの詳細な解析によって、様々な形態のメチル化の間の複雑な関係を示唆する様々な状況における近位メチル化の間の明確な相関を特定しています。

 

明らかに、単一塩基分解能でのDNAメチル化部位をゲノムワイドに同定し、DNA-タンパク質相互作用解析などと組み合わせた解釈を行うことは、生物の複雑なプロセスを解明する上で重要であると言えます。

 

近年、ハイスループットDNAシークエンシングの劇的な進歩により、ゲノム全体にわたってDNAメチル化部位を単一塩基分解能でマッピングすることが可能になりました。

 

メチル化シトシンの検出手法

ゲノムワイドにメチル化シトシンを検出する様々な方法のうち、バイサルファイト処理を用いる標準的な2つの手法を紹介します。

BS-seq

DNAメチル化の高分解能検出のブレークスルーは、変性条件下の亜硫酸水素ナトリウムによるDNAの処理がメチルシトシンではなくシトシン(非メチル化シトシン)を変換する実験手順である亜硫酸水素塩(バイサルファイト:BS)処理の出現と言われています。

 

バイサルファイト処理を行うと非メチル化シトシンのみがスルホニル化、脱アミノ化、脱スルホン化反応を経てウラシルに変換されます。バイサルファイト処理したDNAを鋳型としてPCRを行うと、ウラシルとなった非メチル化シトシンと、変化していないメチル化シトシンとでは、増幅後のDNA配列が異なります。

バイサルファイト処理した DNA の配列と未処理の DNA の配列の塩基配列決定を行い、これらの配列の差異から、メチル化または非メチル化領域を特定することができます。

長所

・プライマーが認識する領域のすべてのCpG部位のメチル化状態を捉えることができます。

・CpG部位が密であっても解析が可能です。

 

短所

・一塩基多型をメチル化と誤認する可能性があります。これを防ぐためにあらかじめ実験に利用する対象物のゲノムをクローニングし配列決定を行う必要があります。

 

BS-seqについてはバイサルファイト処理の前にメチル化または標的領域を濃縮する技術も開発されています。

 

MethylC-seq

目的のDNAにSssI methylaseを作用させ完全にメチル化されたDNAを作成します。

これはメチル化状態を判断する際に必要となるコントロールとして利用されます。

次に目的DNAとコントロールDNAへバイサルファイト処理を行います。

メチル化DNA特異的プライマー(Mプライマー)と非メチル化DNA特異的プライマー(Uプライマー)を設計し、バイサルファイト処理したDNAのPCRを行います。

増幅産物の塩基配列を比較し、メチル化領域を特定します。

シロイヌナズナ、ヒト、カイコおよびニワトリの単一塩基分解能のDNAシトシンメチノムマップがMethylC-seqによって生成されています。

長所

・迅速な解析が可能です。

・少量のサンプルからメチル化を検出することができます。そのため、多検体の解析や微量メチル化DNAの解析に有効です。

 

短所

・CpG部位が非常に密集している場合はプライマー設計が難しい場合があります。

 

 

ある研究では、DNAメチル化解析とmRNA-seqを利用し、DNAメチル化の変化と遺伝子発現の関係を調べました。 mRNA-seq法と組み合わせてことで、DNAメチル化パターンの変化に伴い、何百もの遺伝子、トランスポゾンや遺伝子間転写物の量が変化したことを明らかにしています。

 

まとめ

DNAメチル化検出の代表的な手法として、BS-seqとMethylC-seqがあります。それぞれの長所と短所を考慮し、目的に見合った解析手法の選択が重要です。

 

参考論文

Genome Res. 2009. 19: 959-966