次世代シーケンサーの仕組み

DNAシーケンスは、DNAの塩基配列を決定する手法です。生物のゲノム配列の解読、遺伝子発現の解析、エピゲノム修飾のプロファイリングなど、ゲノム・エピゲノム解析の多くの場面で利用されています。

このシーケンスを行う装置がシーケンサーです。従来は、サンガーシーケンスという手法を用いたシーケンサーが広く使われてきました。しかし近年、莫大な塩基配列データを高速かつ安価に得ることができる「次世代」シーケンサーが開発されたことで、エピゲノム研究は飛躍的に加速しました。

ここでは、各社から販売されている次世代シーケンサーが、塩基配列を決定する仕組みを紹介します。まずは、従来型シーケンサーが塩基配列を決定する方法を簡単に説明します。

第1世代のシーケンス技術(サンガーシーケンス)

従来型のシーケンサーは、Sanger法(ジデオキシ法)を基本原理としています。

Sanger法では、DNA合成酵素を用いて、配列を読みたいDNA断片を鋳型にDNA合成反応を行います。このとき、本来のDNA合成反応の基質であるデオキシヌクレオチド(dATP・dGTP・dCTP・dTTP)に加え、ジデオキシヌクレオチド(ddATP・ddGTP・ddCTP・ddTTP)のうち1種類を一定量加えておきます。ジデオキシヌクレオチドはDNAに取り込まれますが、次のヌクレオチドが結合するために必要なヒドロキシル(OH)基がないため、そこで伸長が止まってしまいます。本来の基質であるデオキシヌクレオチドも加えてあるので、ジデオキシヌクレオチドの取り込みによる伸長の停止はときどき起きることになります。例えば、ddATPを加えた場合、塩基がAの位置でランダムに伸長が止まった様々な長さのDNA断片ができます。電気泳動で長さ別に分離することで、DNA断片のうちどの位置にAがあるかを知ることができます。これを4つ全ての塩基について行うことで、塩基配列を決定することができます。

現在広く利用されているシーケンサーは、3つの工夫を施すことでシーケンスを自動化・効率化しています。1つ目は、別々の蛍光色素で標識した4種類のddNTPを用いることで、塩基別に反応を行わなくても1度の反応で済みます。2つ目は、PCRでDNA合成反応を行うことで、少ない量のDNAからでもシーケンスすることが可能です。3つ目に、電気泳動にキャピラリー電気泳動という手法を用いることで、ハイスループットに配列を決定することができます。

次世代シーケンシング技術

次世代シーケンシングは、サンガー法とは異なる原理で高速かつ安価に大量の塩基配列を決定できるシステムです。

主要な次世代シーケンサーのプラットフォームとして、Illumina(Solexa)社、Roche(454 Life Sciences)社、SOLiD/Thermo Fisher Scientific(Applied Biosystems)社、Ion Torrent/Thermo Fisher Scientific(Ion Torrent Systems)社、Helicos BioSciences社、Pacific Biosciences社、Oxford Nanopore Technologies社から販売されていますが、解析の仕組みはそれぞれ異なっています。

ここでは、シーケンサーで塩基配列を解読できるようにするためのサンプルの前準備(テンプレート調製)の方法と、塩基配列の読み取り方(シーケンシング)の仕組みに分けて説明します。

テンプレート調製

配列を読み取るDNAは、シーケンシングに必要な人工的な配列(アダプター)を結合する必要があります。テンプレートには、プラットフォームによって、目的のDNAをPCRでクローン増幅する必要がある場合と、PCRを必要とせず1分子でよい場合があります。テンプレートは固体表面やビーズなどの担体に固定され、シーケンスにかけられます。

クローン増幅したテンプレート(PCRを必要とする方法)

ほとんどのプラットフォームでは、塩基情報を示す蛍光シグナルや電気シグナルを単一DNA分子からでは検出できないので、クローン増幅したテンプレートが必要です。増幅の方法には、エマルションPCRと固体上でのPCRがあります。

RocheやThermo Fisher Scientificのプラットフォームは、エマルションPCRを採用しています。エマルションPCRは、油中の水滴内でPCRを行う方法です。まずDNAフラグメントにアダプターをライゲーションします。その後、1つの水滴につき、PCRプライマーが固定されたビーズ1つとDNAフラグメント1分子が入る条件下でPCRを行うと、表面に数千コピーの同じDNA断片が固定化されたビーズができます。このビーズをガラス表面に固定化したり(SOLiD)、あるいはビーズ1つがちょうど入る大きさの微小なウェルに充填したりして(Roche, Ion Torrent)、シーケンスを行います

Illuminaのプラットフォームは固体上でのPCRを採用しています。プライマーが高密度に固定されたガラス基板上でPCR(ブリッジPCRと呼ばれています)を行うことで、同じDNA断片からなるクラスターを形成します。

1分子テンプレート(PCRを必要としない方法)

1分子のDNAで配列決定ができるシーケンサーでは、PCRが必要ありません。PCRで増幅すると、増幅エラーによって塩基配列に変異が生じ、後の解析で配列バリアントのように検出されてしまったり、あるいはフラグメントの塩基配列の違いによって増幅効率の差が生じることで(PCRバイアス)、元のフラグメント群と組成が変化してしまったりする懸念があります。したがって、PCRが必要ない解析は、RNA-seqのように元の塩基配列のバリエーションを残しておきたい解析を行う際に大きなアドバンテージになります。

Helicos BioSciencesのプラットフォームでは、固体上に固定されたプライマーにテンプレートをハイブリダイズさせるものと、逆にテンプレートを固体上に固定してプライマーをハイブリダイズさせるものがあります。Pacific Biosciencesのプラットフォームでは、DNA合成酵素が固体上に固定してあり、プライマーが結合したテンプレートがここに結合することになります。

シーケンシング

Cycle reversible termination

可逆的ターミネーター法を用いて、塩基の取り込み、蛍光シグナルのイメージング、ターミネーターや蛍光修飾の切断、というサイクルを繰り返していく手法です。

DNA合成酵素を用いて、テンプレートを鋳型にして相補的なヌクレオチドを付加して塩基配列を解読していきます。このヌクレオチドには、2つ工夫が施されています。1点目は、蛍光標識が施されています。蛍光シグナルを検出することにより、取り込まれた塩基を決定します。2点目は、塩基の伸長を進めないための修飾(Terminating/inhibiting group)が施されており、ヌクレオチドが取り込まれるとそれ以上伸長が進まないようになっています。そのため、相補的な塩基が1つだけ取り込まれて1度の反応が終わります。取り込まれなかったヌクレオチドは、ウォッシュされて反応系から取り除かれます。次に、蛍光シグナルをイメージングすることで取り込まれた塩基の種類を決定します。次に、取り込まれたヌクレオチドから、蛍光標識とTerminating/inhibiting groupを切り取ります。Terminating/inhibiting groupが取り除かれたので、初めに戻ってヌクレオチドの取り込みからサイクルを繰り返すことができます(この仕組みが可逆的ターミネーター法です)。この工程を繰り返すことにより、塩基配列を決定していきます。

Illuminaのプラットフォームでは、4つの塩基が別々の蛍光シグナルを発するようになっており、4種類のうちどの塩基が取り込まれたのかを色の違いで決定できます。Helicos BioSciencesのプラットフォームでは、4つの塩基が同じ蛍光で修飾されているため、1ヌクレオチドずつ反応を行うことで塩基配列を決定していきます。例えば、Cだけを加えてときに蛍光シグナルが検出されればCが取り込まれたと決定でき、次はGだけを加えて蛍光シグナルを検出する、という形で4塩基の反応を別々に進めていきます。

この技術の鍵となるTerminating/inhibiting groupは、プラットフォームによって異なっています。1つには、Sanger法で使うジデオキシヌクレオチドと似た発想で、ヌクレオチドの伸長に必要なヒドロキシル基が反応できないように直接修飾されている手法があります。例えば、Illuminaのプラットフォームではヒドロキシル基がO-azidomethyl基で修飾されています。また、Helicos BioSciencesのプラットフォームのように、ヒドロキシル基は直接修飾されていませんが、別の部分にヌクレオチドの伸長を邪魔するような修飾が施されている手法もあります。

Sequencing by ligation

DNA合成酵素の代わりに、DNAの断片同士を結合する酵素であるDNAリガーゼを利用します。Thermo Fisher Scientific社のSOLiDが採用している手法です。Cycle reversible terminationと似た形で、蛍光標識されたプローブをプライマーに結合(ライゲーション)し、蛍光シグナルをイメージングすることで取り込まれたプローブを決定する、というサイクルを繰り返していきます。

プローブは、テンプレートの相補配列として取り込まれる2塩基と、それに続く数塩基の配列からなります。2塩基の組み合わせはAA, AC, AG, AT, …の16通りがありますが、これらが4種類の蛍光で識別されています(例えば、AA, CC, GG, TTは青色)。サイクルが終わるたびに、プローブの6塩基目以降が蛍光標識とともに切断されます。このサイクルを10サイクル繰り返すと、5塩基おきに2塩基分の蛍光シグナルが決定されます。次に、プライマーを外し、1塩基左に位置がずれた新たなプライマーを使ってシーケンシングサイクルを行うことで、先ほどから1塩基分左にずれた形で蛍光シグナルを決定していきます。プライマーをずらしながら、このサイクルを合計5回行います。得られた色の配列をもとに、リファレンスゲノム(すでに明らかになっている目的生物種の全ゲノム配列)を参照しながら、サンプルの塩基配列を決定していきます。

パイロシーケンシング(Pyrosequencing)

パイロシーケンシングは、蛍光シグナルではなく、化学発光シグナルを利用します。ヌクレオチドが伸長するときに放出されるリン酸を、酵素反応によって可視光に変換して検出します。Rocheのプラットフォームが採用している手法です。

まず、エマルションPCRで作製したテンプレートビーズを、PicoTiterPlate(PTP)ウェルに充填します。次に、リン酸を化学発光に変換するための酵素であるスルフリラーゼとルシフェラーゼが結合したより小さなビーズを、テンプレートビーズの周辺に充填します。リン酸はスルフリラーゼによってATPに変換され、そのATPがルシフェラーゼによって化学発光に変換されます。このPTPウェル上に4種類のdNTPを1種類ずつ順々に流し、塩基が取り込まれると放出される化学発光をCCDカメラで検出します。どのdNTPを加えたときに化学発光がどれだけ検出されたかを調べれば、塩基配列を決定することができます。ある塩基が連続している場合には、その数に比例して強い化学発光シグナルが検出されます。

イオントレント半導体シーケンシング

塩基が伸長するときに起こる水素イオン(プロトン)の放出を電気的に検出します。Thermo Fisher Scientific社のIon Torrentが採用している手法です。

解析の流れはパイロシーケンスとよく似ています。エマルションPCRで作製したテンプレートビーズをウェルに充填し、4種類のdNTPを1種類ずつ順々に流していきます。塩基が取り込まれると水素イオンが放出されます。Ion Torrentは、これによって起こるpHの変化をウェルの底部にあるセンサーで検知し、電圧の変化に変換します。どのdNTPを加えたときに電圧の変化がどれだけ起こるかを調べれば、塩基配列を決定することができます。

リアルタイムシーケンシング

文字通りDNA合成酵素による塩基の取り込みをリアルタイムに観測することで塩基配列を決定する手法で、Pacific Biosciences社のプラットフォームPacBioがこの手法の先駆けです。1分子のDNAから解析でき、数千~数万ベースというロングリードを読み取ることができるのが特長です。

この手法で使うヌクレオチドには、リン酸基の先に蛍光標識が付けられています。4種類のdNTPが別々の蛍光で標識されており、蛍光シグナルにより塩基配列を決定していきます。鍵となるのは、底面にDNA合成酵素1分子が結合された、Zero-mode waveguide(ZWM)という直径100 nmのウェル状のナノ構造です。蛍光物質が蛍光を発するためには特定の波長の光(励起光)を照射する必要がありますが、100 nmという長さは、励起光の波長よりも短いものです。そのため、底部から当てた励起光はZWMを貫通することができず、DNA合成酵素がある底部の限られた領域までしか届きません。つまり、ヌクレオチドがこの領域に到達したときにしか蛍光を発しないようになっています。ヌクレオチドが偶然この領域に入り込んで一時的に蛍光を発することもありますが、DNA合成酵素によって取り込み反応の基質になっているヌクレオチドだけが十分長い時間この領域に存在して蛍光を発し続けることになります。この蛍光を検出することで塩基配列を決定していきます。塩基の取り込みが終わると、蛍光標識はリン酸基と一緒に切り取られ、速やかにZWMの外に拡散して検出されなくなります。

ナノポアシーケンシング

ナノポアシーケンシングは、蛍光ラベルなどに頼らずDNAの塩基配列を読み取ることのできる手法で、こちらも1分子のDNAから解析できるリアルタイムシーケンスです。Nanopore Oxford Technologies社がMinION, GridION, PromethIONといったナノポアシーケンサーを販売しています。

ナノポアは、微小な孔のことです。ナノポアが埋め込まれた膜で隔てたイオン溶液に電圧をかけると、イオンがナノポアを通過することによって電流が流れます。このとき、ナノポアをDNAなどの分子が通過すると、イオンの流れがブロックされるため、電流が妨げられます。この電流の妨げられ方は、ナノポアを通過した分子の大きさや形によって異なります。DNAで言えば、A, T, G, Cの4種類の塩基が通過したときの電流の妨げられ方は微妙に異なります。ナノポアシーケンシングとは、ナノポアにDNAを通し、電流の妨げられ方から塩基配列を決定していく手法です。

ナノポアには大きく分けて2種類があります。1つは生物学的なナノポアで、微小な孔を形成する自然界のタンパク質を用いて作られたものです。細菌が分泌するα-hemolysinを用いたものが有名です。もう1つは固体ナノポアで、ケイ素化合物などの合成素材に人工的に微小な孔を空けることで作られます。生物学的ナノポアに比べると化学的・物理的に耐久性が高いことが特長です。この両者を合わせたハイブリッドタイプのナノポアもあります。より洗練されたナノポアシーケンシング技術の確立に向けて、新たな素材や技術を用いたナノポアの開発が進められているようです。

ナノポアシーケンシングは装置の小型化も実現しており、MinIONはポケットサイズの次世代シーケンサーです。1分子のDNAの塩基配列を迅速かつ安価に、しかもロングリードで読むことのできる将来性の高い技術です。

参考文献

  1. Metzker ML. Sequencing technologies – the next generation. Nature Reviews Genetics. 2010;11(1):31-46. doi: 10.1038/nrg2626.
  2. Rothberg JM, Hinz W, Rearick TM, Schultz J, Mileski W,et al. An integrated semiconductor device enabling non-optical genome sequencing. Nature. 2011;475(7356):348-52. doi: 10.1038/nature10242.
  3. Eid J, Fehr A, Gray J, Luong K, Lyle J, et al. Real-time DNA sequencing from single polymerase molecules. Science. 2009;323(5910):133-8. doi: 10.1126/science.1162986.
  4. Oxford Nanopore Technologies. Retrieved from https://nanoporetech.com/
  5. Feng Y, Zhang Y, Ying C, Wang D, Du C. Nanopore-based fourth-generation DNA sequencing technology. Genomics Proteomics Bioinformatics. 2015;13(1):4-16. doi: 10.1016/j.gpb.2015.01.009.


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